Сайт-специфическое включение неприродной аминокислоты в белки клеток млекопитающих

Для включения 3-йод-L-тирозина в белки клеток млекопитающих была разработана пара супрессорной тРНК(Tyr) и мутантной тирозил-тРНК-синтетазы (TyrRS). Сначала ген супрессорной тРНК(Tyr) Escherichia coli был мутирован в трех положениях D-стебля для создания внутреннего промотора, обеспечивающего экспрессию. Однако эта тРНК вместе с соответствующей ей TyrRS не проявляла супрессорной активности в клетках млекопитающих. Затем было установлено, что подавление янтарного кодона может происходить при использовании гетерологичной пары TyrRS E. coli и супрессорной тРНК(Tyr) Bacillus stearothermophilus, которая естественным образом содержит промоторную последовательность. Кроме того, эффективность такого подавления значительно повышалась, когда супрессорная тРНК экспрессировалась из кластера генов, в котором ген тРНК был тандемно повторен девять раз в одном направлении. Для включения 3-йод-L-тирозина в клетках млекопитающих экспрессировали его специфичный вариант TyrRS E. coli, TyrRS(V37C195), недавно созданный нами, совместно с супрессорной тРНК(Tyr) B. stearothermophilus, при добавлении 3-йод-L-тирозина в ростовую среду. В результате 3-йод-L-тирозин включался в белки в положениях янтарного кодона с эффективностью >95%. Наконец, было продемонстрировано условное включение 3-йод-L-тирозина, регулируемое индуцируемой экспрессией гена TyrRS(V37C195) с тетрациклин-регулируемого промотора.