Выбор праймера и метод извлечения микробиомы ксилемы — важные факторы при оценке бактериального сообщества ксилемы оливковых деревьев

Понимание уникальной и слабо изученной микробной среды ксилемного сока становится всё более важным для здоровья растений, поскольку она может включать микроорганизмы, защищающие растения от патогенов, ограниченных ксилемой, таких как Verticillium dahliae и Xylella fastidiosa. В этом исследовании мы оценивали влияние метода извлечения бактериальных сообществ ксилемы, возраста растения и выбора ПЦР-праймеров на характеристику состава бактериального сообщества ксилемы с использованием подхода секвенирования нового поколения (NGS). Ксилемный сок извлекали из сосудов ксилемы с помощью манометра Шоландера (Scholander pressure chamber) или макерировали древесную стружку, полученную из тканей ксилемы ветвей 10-летних оливковых деревьев или всей кроны 1-летних саженцев оливы. Дополнительно мы сравнили четыре пары ПЦР-праймеров, нацеленных на ген 16S rRNA, по их эффективности в предотвращении коамплификации митохондриального и хлоропластного 16S rRNA, что представляет собой существенную проблему в метабаркодинге. Наибольшие доли митохондриальных и хлоропластных чтений были получены при использовании древесных чипов ксилемы с парами праймеров PCR1-799F/1062R (76,05%) и PCR3-967F/1391R (99,96%). Напротив, пары праймеров PCR2-799F/1115R и PCR4-799F/1193R показали наименьшую амплификацию митохондриального 16S rRNA (<27,48%), отсутствие последовательностей хлоропласта и наибольшее число выявленных бактериальных OTU (соответственно 254 и 266). Важно отметить, что только 73 из 172 и 46 из 181 родов были общими между ксилемным соком и древесными чипами после амплификации праймерами PCR2 или PCR4 соответственно, что указывает на значительную систематическую ошибку в описании бактериального сообщества в зависимости от выбора праймеров. В целом наиболее обильные бактериальные роды (>60% чтений) включали Anoxybacillus, Cutibacterium, Pseudomonas, Spirosoma, Methylobacterium–Methylorubrum и Sphingomonas; однако их относительная значимость варьировала в зависимости от матрицы, использованной для экстракции ДНК, и применяемых пар праймеров, тогда как возраст растения оказывал наименьшее влияние. Эти результаты помогут оптимизировать анализ обитающих в ксилеме бактерий в зависимости от того, используется ли для извлечения ДНК весь ксилематический материал или ксилемный сок, а также улучшат понимание факторов, формирующих состав бактериального сообщества ксилемы оливы.