Удаление шума из ампликонов, полученных методом пиросеквенирования

ПРЕДПОСЫЛКИ: Во многих приложениях экологической геномики гомологичный участок ДНК из разнообразного образца сначала амплифицируют методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), а затем секвенируют. Технология секвенирования нового поколения — пиросеквенирование 454 — позволила получать значительно больше прочтений ПЦР-ампликонов, чем когда-либо ранее. Это произвело революцию в изучении микробного разнообразия, поскольку теперь стало возможным секвенировать значительную долю генов 16S рибосомной РНК (рРНК) в сообществе. Однако все более очевидно, что из-за большого числа прочтений и отсутствия консенсусных последовательностей крайне важно отличать шум от истинного разнообразия последовательностей в этих данных. В противном случае оценки числа присутствующих типов или операционных таксономических единиц (OTU) оказываются завышенными. Важны три источника ошибок: ошибки секвенирования, однонуклеотидные замены, возникающие при ПЦР, и ПЦР-химеры. Мы представляем AmpliconNoise — развитие алгоритма PyroNoise, способное раздельно удалять ошибки секвенирования 454 и однонуклеотидные ошибки ПЦР. Мы также вводим новую программу удаления химер Perseus, использующую информацию об abundance последовательностей, связанную с данными пиросеквенирования. Для количественной оценки влияния каждого источника ошибок на завышение числа OTU и валидации этих алгоритмов мы использовали наборы данных, в которых образцы с известным разнообразием амплифицировали и секвенировали. РЕЗУЛЬТАТЫ: AmpliconNoise существенно превосходит альтернативные алгоритмы, снижая частоту ошибок на одну позицию как для протокола GS FLX, так и для новейшего протокола Titanium. Все три источника ошибок приводят к завышению оценок разнообразия. В частности, образование химер имеет ранее недооцененное значение, зависящее от протокола амплификации. Мы показываем, что AmpliconNoise позволяет точно оценивать число OTU. Не менее важно, что AmpliconNoise формирует правильный набор OTU даже при малых различиях между последовательностями. Мы демонстрируем, что Perseus обладает очень высокой чувствительностью и способен обнаруживать 99% химер, что критически важно при их высокой частоте. ВЫВОДЫ: Amplic...