Эпистаз высокого порядка в каталитической способности дигидрофолатредуктазы формирует изрезанный ландшафт приспособленности в условиях селекции триметопримом

Эволюционные ландшафты приспособленности нескольких белков-мишеней антибиотиков были всесторонне картированы, что выявило сильный эпистаз высокого порядка между мутациями; однако понимание этих эффектов на биохимическом и структурном уровнях оставалось нерешённой задачей. В данной работе мы провели обширное экспериментальное и вычислительное исследование, чтобы количественно охарактеризовать эволюционную динамику дигидрофолатредуктазы (DHFR) Escherichia coli в условиях отбора, индуцированного триметопримом. Для этого мы разработали новый анализ in vitro, позволяющий быстро характеризовать кинетику DHFR в стационарном состоянии. Биохимическая и структурная характеристика мутаций, придающих устойчивость и затрагивающих в общей сложности десять аминокислотных остатков, расположенных в кармане связывания субстрата DHFR, выявила выраженные изменения каталитической эффективности мутантных ферментов DHFR. Затем мы измерили биохимические параметры Km, Ki и kcat для библиотеки мутантов, содержащей все возможные комбинации шести мутаций DHFR, придающих устойчивость, и количественно оценили эпистатические взаимодействия между ними. Мы обнаружили, что эпистаз высокого порядка в каталитической способности DHFR, отражаемый параметрами kcat и Km, формирует изрезанный ландшафт приспособленности при селекции триметопримом. В совокупности полученные данные дают наглядный пример того, как эпистатическое сопряжение на уровне биохимических параметров может приводить к сложным ландшафтам приспособленности, и указывают на новые стратегии разработки ингибиторов, специфичных для мутантов.