Функциональная реконституция рекомбинантного фосфоламбана с использованием скелетной Ca2+-АТФазы кролика

Фосфоламбан (PLB) представляет собой небольшой трансмембранный белок, локализованный в саркоплазматическом ретикулуме (SR) сердца и регулирующий активность Ca2+-АТФазы в ответ на β-адренергическую стимуляцию. С использованием системы экспрессии на основе бакуловируса в клетках Sf21 мы получили миллиграммовые количества дикого типа PLB. После очистки методом аффинной хроматографии на антителах функцию рекомбинантного PLB оценивали путем его реконституции с Ca2+-АТФазой, очищенной из саркоплазматического ретикулума скелетных мышц. Результаты, полученные для рекомбинантного PLB, не отличались от результатов, полученных для очищенного кардиального PLB собаки. В частности, PLB снижал кажущееся сродство Ca2+-АТФазы к кальцию, но не влиял на Vmax. При pCa 6,8 PLB на 50% ингибировал как поглощение кальция, так и активность Ca2+-АТФазы. Это ингибирование полностью устранялось добавлением моноклонального антитела к PLB, которое имитирует физиологические эффекты фосфорилирования PLB. Максимальные регуляторные эффекты PLB наблюдались при приблизительной молярной стехиометрии PLB/Ca2+-АТФаза 3:1. Также были исследованы пептиды, соответствующие двум основным доменам PLB. Мембранный домен PLB26-52, по-видимому, разобщал гидролиз АТФазой и транспорт кальция, хотя проницаемость реконституированных везикул не изменялась. Цитоплазматический пептид PLB1-31 оказывал незначительное влияние даже при 300-кратном молярном избытке по отношению к Ca2+-АТФазе.