Различная роль фрагментов сигнала секреции α-спаривания в Pichia pastoris для гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, полученного из дикого типа или кодон-оптимизированной копии гена

Актуальность: Метилотрофный дрожжевой организм Pichia pastoris широко используется для производства человеческих терапевтических белков, однако выход гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF) в этой системе невысок. Целью данной работы было повышение внеклеточного производства G-CSF посредством введения мутаций в лидирующую последовательность (α-mating factor) и использования кодон-оптимизированной копии G-CSF. Проведён биоинформатический анализ для объяснения наблюдаемых эффектов мутаций на секрецию G-CSF. Результаты: Мутации в про-регионе секреторного сигнала α-mating factor (MAT), размещённые рядом с кодон-оптимизированной (CO) копией G-CSF, в частности делецией Δ57-70, обеспечили наибольший титр G-CSF — 39.4 ± 1.4 мг/л. Усиливающий эффект этой делецией также наблюдался при её расположении перед копией гена дикого типа (WT). Удаление аминокислот 30–43 в пропептиде, слияние которого с WT-G-CSF, полностью прекращало секрецию G-CSF, тогда как при расположении той же делеции перед конструкцией CO-G-CSF эффекта не наблюдалось. Аналогично, Matα:Δ47-49 перед WT-G-CSF снижало секрецию, в то время как при наличии этой делеции перед CO-G-CSF эффекта не фиксировали. Эти данные указывают, что более высокая скорость трансляции, достигаемая посредством кодон-оптимизации, может преодолевать регуляторное влияние указанных сегментов сигнал-пептида. Потеря секреции, вызванная Δ30-43 в WT-G-CSF, частично восстанавливалась (~60%) при дополнительном введении Δ57-70. Негативный эффект Δ47-49 в WT-G-CSF также частично компенсировался (~60%) добавлением Δ57-70, что подчёркивает значимость региона 47–49. Стимулирующий эффект Δ57-70 подтверждён в конструкции с двойной делецией (Matα:Δ57-70;47-49) перед CO-G-CSF. Прогнозы вторичной и третичной структуры с использованием I-TASSER позволили связать структурные изменения с их влиянием на секрецию: сегмент Δ57-70 составляет значительную часть третьей α-спирали пред-пропептида, и его искажение увеличивает гибкость петли, способствуя взаимодействию с грузовым белком. Для секреции оказалась необходима минимальная длина петли. Жёсткий контроль процесса секреции, по-видимому, может быть преодолён путём изменения вторичной структуры сигнальных пептидов, что позволяет тонко настроить и улучшить секрецию других терапевтических белков в данной системе экспрессии. Выводы: Среди протестированных усечений пропептида (Matα:Δ57-70, Matα:Δ47-49, Matα:Δ30-43, Matα:Δ57-70;30-43, Matα:Δ57-70;47-49) сигнала секреции α-MAT, Matα:Δ57-70 в сочетании с CO-G-CSF давала наивысший титр G-CSF. Напротив, Matα:Δ30-43 и Matα:Δ47-49 в сочетании с WT-G-CSF снижали секрецию, что указывает на ключевую роль этих сегментов в секреции грузового белка.