Одностадийная инактивaция хромосомных генов Escherichia coli K-12 с использованием PCR‑продуктов

Разработан простой и высокоэффективный метод разрушения хромосомных генов Escherichia coli, в котором праймеры для ПЦР обеспечивают гомологию целевым генам. В этой процедуре рекомбинация требует рекомбиназы Red бактериофага лямбда, которая синтезируется под контролем индуцибельного промотора на легко устранимом плазмидном векторе с низкой копийностью. Для демонстрации применимости подхода мы получили ПЦР‑продукты, используя праймеры с 36–50 нуклеотидными участками гомологии к областям, соседним с инактивируемым геном, и матричные плазмиды, несущие гены антибиотикорезистентности, окружённые сайтами FRT (FLP recognition target). С помощью соответствующих ПЦР‑продуктов мы сделали 13 различных нарушений хромосомных генов. Мутанты генов или оперонов arcB, cyaA, lacZYA, ompR-envZ, phnR, pstB, pstCA, pstS, pstSCAB-phoU, recA и torSTRCAD были выделены в виде колоний, устойчивых к антибиотикам, после введения в бактерии, несущие плазмиду с экспрессией Red, синтетической (ПЦР‑полученной) ДНК. Гены резистентности затем удалялись с помощью вспомогательной плазмиды, кодирующей рекомбиназу FLP, которая также легко устраняется. Эта процедура должна быть широко полезна, особенно при геномном анализе E. coli и других бактерий, поскольку её можно применять в диких (wild-type) клетках.