Компоненты системы убиквитин-протеинлигазы: разрешение, аффинная очистка и роль в распаде белков

Путём аффинной хроматографии грубого ретикулоцитарного экстракта на убиквитин-Сефарозе были выделены три фермента, необходимые для конъюгации убиквитина с белками. Один из них — активирующий фермент убиквитина (E1), который ковалентно связывается с аффинной колонкой в присутствии ATP и может быть специфически элюирован AMP и пирофосфатом (Ciechanover, A., Elias, S., Heller, H., и Hershko, A. (1982) J. Biol. Chem. 257, 2537-2542). Второй фермент, обозначенный как E2, связывается с убиквитиновой колонкой при наличии E1 и ATP и элюируется тиоловым соединением в высокой концентрации. Третий фермент, обозначенный как E3, адсорбируется на аффинной колонке за счёт нековалентных взаимодействий и может быть элюирован высоким содержанием солей или повышением pH. Наличие всех трёх ферментов абсолютно необходимо для конъюгации 125I-убиквитина с белками. Все три аффинно очищенных фермента также требуются для расщепления 125I-альбумина до кислоторастворимого материала в присутствии убиквитина, ATP и неадсорбированной фракции аффинной колонки. Следующие наблюдения указывают, что функция E2 заключается в переносе активированного убиквитина к месту конъюгации в виде тиолового ангидридного (тиолового сложного эфира) промежуточного соединения E2-убиквитин. (a) E2 быстро инактивируется иодоацетамидом, но может быть защищён от инактивации предварительным инкубированием с E1, ATP и убиквитином. Это предполагает перенос активированного убиквитина, опосредованный E1, на иодоацетамид-чувствительный тиоловый сайт E2. (b) Требования к связыванию E2 с убиквитиновой колонкой и режим его элюции, приведённые выше, согласуются с представлением о формировании ковалентной связи между E2 и сефароз-связанным убиквитином. (c) При инкубации 125I-убиквитина с E1 и ATP с последующим добавлением очищенного E2 активированный убиквитин переносится с E1 на несколько низкомолекулярных форм E2, как показано методом электрофореза в денатурирующем полиакриламидном геле с натриевым додецилсульфатом. Связь убиквитина со всеми этими формами имеет характеристики тиолового сложного эфира. При дальнейшей инкубации с E3 и белковым субстратом для конъюгации активированный убиквитин переносился с различных форм E2-убиквитина на стабильные убиквитин-белковые конъюгаты. Таким образом, E3 вовлечён в заключительный этап работы лигазной системы.