Бисульфитное секвенирование редуцированного представления для сравнительного анализа метилирования ДНК с высоким разрешением

Мы описываем крупномасштабный случайный подход, получивший название бисульфитного секвенирования редуцированного представления (RRBS), для анализа и сравнения паттернов метилирования генома. Рестрикционные фрагменты BglII отбирали по размеру в диапазоне 500–600 п. о., снабжали адаптерами, обрабатывали бисульфитом, амплифицировали методом ПЦР, клонировали и секвенировали. Библиотеки RRBS конструировали из эмбриональных стволовых клеток мыши, а также из эмбриональных стволовых клеток, лишённых ДНК-метилтрансфераз Dnmt3a и Dnmt3b и характеризующихся сниженным (kd) уровнем Dnmt1 (Dnmt[1(kd),3a−/−,3b−/−]). Секвенирование 960 клонов RRBS из клеток Dnmt[1(kd),3a−/−,3b−/−] дало 343 кб нерепундирующейся бисульфитной последовательности, охватывающей 66 212 цитозинов генома. Все цитозины, за исключением 38, были превращены в урацил, что указывает на эффективность конверсии более 99,9%. Среди оставшихся цитозинов 35 находились в динуклеотидах CpG, а 3 — в динуклеотидах CpT. Метилирование вне контекста CpG было снижено более чем в 250 раз по сравнению с эмбриональными стволовыми клетками дикого типа, что согласуется с ролью Dnmt3a и/или Dnmt3b в метилировании CpA и CpT. Детальный анализ не выявил ни консенсусной последовательности вблизи метилированных участков, ни свидетельств кластеризации остаточного метилирования в геноме. Полученные результаты указывают на случайную утрату, а не на специфическое поддержание метилирования в клетках Dnmt[1(kd),3a−/−,3b−/−]. Почти полная конверсия бисульфита и в значительной степени несмещённое представление последовательностей в библиотеках RRBS свидетельствуют о том, что случайное дробовое бисульфитное секвенирование может быть масштабировано до уровня полногеномного анализа.