CotA, многомедная оксидаза из Bacillus pumilus WH4, проявляет марганецоксидазную активность

Многомедные оксидазы (MCO) представляют собой семейство ферментов, использующих ионы меди в качестве кофакторов для окисления различных субстратов. Предыдущие исследования показали, что несколько MCO, такие как MnxG, MofA и MoxA, могут выступать в качестве предполагаемых оксидаз Mn(II). Между тем белок оболочки эндоспор CotA у видов Bacillus был подтверждён как типичная MCO. Для изучения взаимосвязи между CotA и окислением Mn(II) ген cotA из высокоактивного штамма Bacillus pumilus WH4, окисляющего Mn(II), был клонирован и сверхэкспрессирован в штамме M15 бактерии Escherichia coli. Очищенный CotA содержал приблизительно четыре атома меди на молекулу и обладал спектроскопическими свойствами, типичными для синих медьсодержащих оксидаз. Важно, что помимо лакказной активности CotA также проявлял значительную марганецоксидазную активность в жидкой культуральной системе и при электрофорезе в нативном полиакриламидном геле. Оптимальная активность Mn(II)-оксидазы наблюдалась при 53°C в буфере HEPES (pH 8,0), содержащем 0,8 mM CuCl2. Кроме того, добавление о-фенантролина и EDTA полностью подавляло активность окисления Mn(II). Удельная активность очищенного CotA по отношению к Mn(II) составляла 0,27 U/mg. Значения Km, Vmax и kcat по отношению к Mn(II) составляли соответственно 14.85±1.17 mM, 3.01×10(-6)±0.21 M·min(-1) и 0.32±0.02 s(-1). Кроме того, активность окисления Mn(II) рекомбинантным штаммом E. coli M15-pQE-cotA значительно повышалась при культивировании как в жидкой среде K, содержащей Mn, так и на агаризованных чашках. После 7 суток культивирования в жидкой среде M15-pQE-cotA удалял 18,2% Mn(II) из среды. Более того, биогенные оксиды Mn были отчётливо обнаружены на поверхности клеток M15-pQE-cotA методом сканирующей электронной микроскопии. Насколько нам известно, это первое сообщение, демонстрирующее прямое наблюдение окисления Mn(II) гетерологично экспрессированным белком CotA. Таким образом, это новое открытие не только создаёт основу для углублённого изучения механизмов окисления Mn(II), но и предоставляет потен...