Высокоуровневая экспрессия мономерного RBD 320–537 S-белка SARS-CoV-2 в стабильно трансфицированных клетках CHO с использованием плазмидного вектора на основе EEF1A1

Шиповидный (S) белок является одним из трех белков, формирующих вирусную оболочку коронавирусов. Пространственная структура S-белка коронавируса 2, вызывающего тяжелый острый респираторный синдром (SARS-CoV-2), сходна со структурой S-белков других коронавирусов млекопитающих, за исключением уникального рецептор-связывающего домена (RBD), который является важным индуктором иммунного ответа хозяина. Рекомбинантный RBD SARS-CoV-2 широко используется в качестве высокоспецифичного минимального антигена для серологических тестов. Корректная экспозиция антигенных детерминант существенно влияет на точность таких тестов: антиген должен иметь правильную конформацию, не содержать потенциально антигенных гликанов невертебрального происхождения и, предпочтительно, обладать профилем гликозилирования, сходным с таковым у нативного S-белка. На основе ранее разработанного вектора p1.1, содержащего регуляторные последовательности гена эукариотического фактора элонгации трансляции 1 альфа (EEF1A1) китайского хомячка, были созданы две экспрессионные конструкции, кодирующие RBD SARS-CoV-2 с C-концевыми метками c-Myc и полигистидиновой меткой. Конструкция RBDv1 содержала нативный вирусный сигнальный пептид, тогда как RBDv2 — сигнальный пептид тканевого активатора плазминогена человека (tPA). Мы трансфицировали клеточную линию CHO DG44, отобрали стабильно трансфицированные клетки и провели несколько раундов амплификации генетической кассеты в геноме под действием метотрексата. Для варианта RBDv2 была получена высокопродуктивная клональная клеточная линия-продуцент. Мы разработали простую схему очистки, которая стабильно обеспечивала выход до 30 мг белка RBD на литр клеточной культуры в обычной встряхиваемой колбе. Очищенные белки анализировали методом электрофореза в полиакриламидном геле в восстановительных и невосстановительных условиях, а также методом гель-фильтрации; для белка RBDv2 содержание мономерной формы в нескольких сериях превышало 90%. Дегликозилирование с помощью PNGase F и масс-спектрометрия подтвердили наличие N-гликозилирования. Антиген, полученный описанным способом, пригоден для серологических тестов и исследований субъединичных вакцин.