Высоковыходная методика получения изолированных паренхиматозных клеток печени крысы

Предложена новая методика, включающая непрерывную рециркулирующую перфузию печени крысы in situ, встряхивание печени в буфере in vitro и фильтрацию ткани через нейлоновую сетку, что приводит к превращению около 50% печени в интактные изолированные паренхиматозные клетки. Перфузионные среды состоят из: (a) кальций-свободного раствора Хэнкса, содержащего 0,05% коллагеназы и 0,10% гиалуронидазы, и (b) магний- и кальций-свободного раствора Хэнкса, содержащего 2 мM этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA). Биохимические и морфологические исследования показывают жизнеспособность изолированных клеток: они дышат в среде, содержащей ионы кальция, синтезируют глюкозу из лактата, непроницаемы для инулина, не окрашиваются трипановой синью и сохраняют структурную целостность. Электронная микроскопия биоптатов, взятых во время и после перфузии, показывает быстрое расщепление десмосом. Участки плазматической мембраны, содержащие гемидесмосомы, инвагинируют, по-видимому отщепляются и мигрируют к центру. Межклеточные плотные контакты и щелевые соединения, однако, сохраняются на интактных изолированных клетках, удерживая небольшие участки цитоплазмы от ранее прилегающих паренхиматозных клеток. Клетки, не сохраняющие плотные и щелевые контакты, демонстрируют набухание вакуолей аппарата Гольджи и вакуолей в периферической цитоплазме. Цитоплазматическая вакуолизация у небольшого процента клеток и потеря калия являются единственными обнаруженными признаками повреждения клеток. По другим измеряемым параметрам изолированные клетки сопоставимы по внешнему виду и функции с нормальными печеночными паренхиматозными клетками in situ.