Проксимальные мутации в центре типа 1 с медью лакказы CotA: спектроскопическая, окислительно-восстановительная, кинетическая и структурная характеристика мутантов I494A и L386A

В настоящем исследовании в лакказе CotA из Bacillus subtilis были заменены два гидрофобных остатка, расположенных вблизи медного центра типа 1. Замена Leu(386) на остаток аланина, по-видимому, вызывает лишь очень незначительные изменения свойств фермента, что указывает на минимальные изменения структуры медных центров. Однако замена Ile(494) на аланин приводит к существенным изменениям фермента. Так, основная полоса видимого поглощения смещается на 16 нм, до 625 нм, и характеризуется повышенной интенсивностью, тогда как интенсивность плеча при приблизительно 330 нм уменьшается в два раза. Моделирование спектра ЭПР мутанта I494A выявляет различия как в медном центре типа 1, так и в медном центре типа 2, отражающие изменения геометрии этих центров. Средневзвешенные по интенсивности частоты, рассчитанные по спектрам резонансного комбинационного рассеяния, составляют 410 см(-1) для фермента дикого типа и 396 см(-1) для мутанта I494A, что указывает на увеличение длины связи Cu–S в медном центре типа 1 мутанта. В целом полученные данные однозначно свидетельствуют о том, что мутация Ile(494) вызывает значительное изменение структуры вблизи медного центра типа 1; это было подтверждено рентгеновской кристаллографией. Кристаллическая структура показывает наличие пятого лиганда — молекулы растворителя — в медном центре типа 1, что приводит к приблизительно тригонально-бипирамидальной геометрии. Окислительно-восстановительные потенциалы мутантов L386A и I494A смещены в отрицательную сторону приблизительно на 60 и 100 мВ соответственно. Эти изменения хорошо коррелируют со снижением каталитической эффективности обоих мутантов по сравнению с ферментом дикого типа.