Структурная и функциональная роль гликозилирования в грибной лакказе из Lentinus sp.

Лакказы представляют собой многомедные оксидазы, катализирующие окисление различных органических и неорганических соединений посредством восстановления O2 до воды. В настоящей работе представлена кристаллическая структура с разрешением 1,8 Å нативной лакказы (обозначенной как nLcc4), выделенной из гриба белой гнили Lentinus sp. Молекула nLcc4 состоит из трех купредоксиноподобных доменов D1–D3, каждый из которых свернут в β-бочоночную структуру типа «греческий ключ». Были установлены участки связывания меди T1 и T2/T3, а также три участка N-гликозилирования — Asn75, Asn238 и Asn458. Анализ начальных скоростей реакции показал, что значения kcat, Km и kcat/Km для nLcc4 при использовании субстрата ABTS составляют соответственно 3 382 с−1, 65,0 ± 6,5 мкМ и 52 с−1 мкМ−1; соответствующие значения для лигносульфоновой кислоты, определенные методом изотермической титрационной калориметрии, составляют 0,234 с−1, 56,7 ± 3,2 мкМ и 0,004 с−1 мкМ−1. Дегликозилированная с помощью Endo H форма nLcc4 (dLcc4), содержащая только по одному остатку GlcNAc в каждом из трех участков N-гликозилирования, обладала кинетической эффективностью и термостабильностью, сходными с таковыми у nLcc4. Выделенный ген Lcc4 содержит открытую рамку считывания длиной 1 563 п. н., кодирующую полипептид из 521 аминокислотного остатка, включая предсказанный сигнальный пептид длиной 21 остаток на N-конце. Рекомбинантные ферменты дикого типа Lcc4 и мутантные формы N75D, N238D и N458D экспрессировали в клетках Pichia pastoris для оценки влияния дефицита отдельных участков гликозилирования на активность фермента. Было установлено, что мутантные ферменты, секретируемые в культуральную среду клеток P. pastoris, сохраняли лишь 4–50% активности лакказы дикого типа. Анализ молекулярно-динамических симуляций различных гликозилированных и дегликозилированных состояний nLcc подтвердил кинетические результаты и показал, что локальные сети водородных связей между соединяющей домены D2–D3 петлей и гликановыми фрагментами играют ключевую роль в активности лакказы. Это исследование дает новые представления о роли гликозилирования в структуре и функционировании грибной лакказы-базидиомицета.