Стабильное высокое объёмное производство гликозилированного рекомбинантного человеческого IFNalpha2b в клетках HEK293

ОБОСНОВАНИЕ: Клетки млекопитающих становятся преобладающей системой экспрессии для производства рекомбинантных белков благодаря их способности обеспечивать правильные фолдинг и сборку белка, а также посттрансляционные модификации. В настоящее время эти системы позволяют получать рекомбинантные моноклональные антитела с высокой объёмной продуктивностью — порядка граммов на литр. Однако их использование для крупномасштабной экспрессии цитокинов обычно приводит к значительно более низкой объёмной продуктивности. РЕЗУЛЬТАТЫ: Мы сконструировали клон клеток HEK293 для высокоуровневого производства гликозилированного рекомбинантного человеческого IFNalpha2b и разработали быстрый и эффективный метод его очистки. Этот клон стабильно продуцирует более 200 мг (до 333 мг) рекомбинантного человеческого IFNalpha2b на литр бессывороточной культуры; белок может быть очищен методом одностадийной катионообменной хроматографии после подкисления и осветления культуральной среды. Эта быстрая процедура обеспечивает получение IFNalpha2b чистотой 98% и выходом более 70%. Очищенный IFNalpha2b мигрирует при электрофорезе в SDS-ПААГ в виде двух форм: основной полосы 21 кДа и минорной полосы 19 кДа. N-концевые последовательности обеих форм идентичны и соответствуют ожидаемому зрелому белку. При нейтральном pH очищенный IFNalpha2b элюируется в виде одного пика; его кажущаяся молекулярная масса, определённая методом эксклюзионной хроматографии, составляет 44 000 Да. О наличии внутримолекулярных и отсутствии межмолекулярных дисульфидных связей свидетельствует тот факт, что невосстановленный IFNalpha2b обладает большей электрофоретической подвижностью, чем восстановленная форма. Обработка очищенного IFNalpha2b нейраминидазой с последующей обработкой O-гликозидазой повышает электрофоретическую подвижность, что указывает на наличие сиалилированного O-связанного гликана. Детальный анализ гликозилирования методом масс-спектрометрии выявляет дисиалилированные и моносиалилированные формы как основные компоненты очищенного IFNalpha2b. Электронно-переносная диссоциация (ETD) показывает, что гликаны связаны с ожидаемым треонином в положении 106. Другие минорные гликозилированные формы и...