Метанол-независимая экспрессия белка с промотором AOX1 посредством инженерии транc-действующих элементов и индукции переключением глюкоза–глицерин в Pichia pastoris

Промотор alcohol oxidase 1 (PAOX1) Pichia pastoris обычно используется для высокоуровневой экспрессии рекомбинантных белков. Однако риски, связанные с метанолом, и жесткий контроль процесса при индукции метанолом часто создают проблемы, особенно при крупномасштабном ферментировании. Путем изучения функций транc-действующих элементов PAOX1 и их комбинированной инженерии мы сконструировали стартовую штаммовую линию PAOX1, не требующую метанола: в ней были идентифицированы и удалены три транскрипционные репрессора и сверхэкспрессирован один транскрипционный активатор. Штамм обеспечивал 77% уровня GFP по сравнению с диким типом в метаноле при росте на глицероле. На модели предшественника инсулина (IP) мы разработали новую стратегию индукции переключением глюкоза–глицерин для этого метанол-независимого штамма. Фаза батча с 40 г/л глюкозы с последующим поддержанием остаточной глюкозы не ниже 20 г/л обеспечивала рост клеток и репрессирование PAOX1; индукция глицерином начиналась после исчерпания глюкозы. Оптимальный биопроцесс обеспечил высокую продукцию IP — 2,46 г/л в 5-литровом биореакторе с заметным снижением потребления кислорода и теплоотделения по сравнению с диким типом в метаноле. Этот мутант и биопроцесс представляют собой безопасную и эффективную альтернативу традиционной системе PAOX1 с репрессией на глицероле и индукцией метанолом.