Метод квадруплексной флуоресцентной количественной ПЦР TaqMan MGB для одновременного выявления вируса панлейкопении кошек, герпесвируса кошек типа 1, калицивируса кошек и вируса инфекционного перитонита кошек

Актуальность: Панлейкопения кошек, инфекция, вызываемая калицивирусом кошек, вирусный ринотрахеит кошек и инфекционный перитонит кошек являются значимыми заболеваниями, угрожающими здоровью кошек. Тенденция к смешанным инфекциям усиливается, тогда как современные диагностические методы имеют ограниченную область применения и не позволяют быстро и одновременно выявлять эти заболевания. Методы: Для разработки праймеров и зондов были выбраны гены вируса панлейкопении кошек (FPV), герпесвируса кошек типа 1 (FHV-1), калицивируса кошек (FCV) и вируса инфекционного перитонита кошек (FIPV). После оптимизации концентраций праймеров и зондов, а также температуры отжига был разработан метод квадруплексной флуоресцентной количественной полимеразной цепной реакции (qPCR) TaqMan с малобороздочным связывающим агентом (MGB) для одновременного выявления этих четырех патогенов. Для построения стандартных кривых были созданы рекомбинантные плазмидные стандарты; оценены чувствительность, специфичность, воспроизводимость и клиническая применимость метода. Результаты: Оптимальные конечные концентрации праймеров для FPV, FHV-1, FCV и FIPV составляли соответственно 0,08, 0,04, 0,06 и 0,12 мкМ, а оптимальные конечные концентрации зондов — соответственно 0,08, 0,08, 0,12 и 0,12 мкМ. Оптимальная температура отжига составляла 59°C. Перекрёстной реакции с распространёнными патогенами, инфицирующими кошек, не наблюдалось. Пределы обнаружения рекомбинантных плазмид T-VP2, T-TK, T-ORF2 и T-N составляли соответственно 50,79, 53,21, 47,91 и 41,25 копий/мкл. Значения R² стандартных кривых составляли соответственно 0,994, 1,0, 0,998 и 0,999, а эффективность амплификации — 105,05%, 96,28%, 98,82% и 96,45% соответственно. Коэффициенты вариации при межсерийных и внутри серийных испытаниях находились в диапазоне от 0,14% до 1,37%. Среди 381 образца фекалий кошек частота выявления FPV, FHV-1, FCV и FIPV составляла соответственно 13,65% (52/381), 18,37% (70/381), 26,77% (102/381) и 9,71% (37/381); совпадение с ранее опубликованными методами и коммерческими наборами составило 100%. Заключение: Успешно разработан чувствительный, специфичный и высокопроизводительный квадруплексный метод количественной флуоресцентной ПЦР TaqMan MGB для одновременного выявления FPV, FHV-1, FCV и FIPV.