Оценка клеточных линий с индуцируемым удалением компонентов cohesin и condensin с помощью анализа морфологии метафазных хромосом

Одной из наиболее продуктивных стратегий определения функции белка является изучение последствий утраты его активности. Для этой цели получают клетки или организмы с нокаутом гена, кодирующего исследуемый белок. Однако многие белки выполняют жизненно важные функции, и при их отсутствии клетки или организмы могут быстро потерять жизнеспособность или фитнес. Для таких белков наиболее эффективным подходом является использование систем индуцируемой деградации белков, часто основанных на ауксин-зависимой деградации. Для внедрения этой системы в млекопитающие клетки необходимо ввести трансген, кодирующий растительную ауксин-зависимую убиквитин-лигазу, и вставить в ген интереса последовательность, кодирующую дегрон-домен. Критически важным этапом при создании клеточных линий для индуцируемого удаления белка является отбор клонов, проявляющих эффективную ауксин-зависимую деградацию целевого белка. Для отбора клонов при удалении архитектурных хроматиновых белков RAD21 (компонент комплекса cohesin) и SMC2 (компонент комплекса condensin) мы предлагаем использовать морфологию метафазных хромосом в качестве удобного функционального теста. В данной работе мы получили серию клонов человеческих клеток HAP1, несущих необходимые генетические конструкции для индуцируемого удаления RAD21 и SMC2. Эффективность деградации оценивают методом проточной цитометрии, вестерн-блоттинга и тестом морфологии метафазных хромосом. По результатам этих тестов клоны со SMC2-дегроном демонстрировали эффективную и полную утрату функции белка при индукции ауксином. Напротив, ни один из клонов HAP1 с RAD21-дегроном не показал полной утраты функции RAD21 после индуцированной деградации; кроме того, у некоторых клонов с RAD21-дегроном наблюдались признаки нарушения функции RAD21 даже без индукции. Тест по морфологии хромосом оказался удобным и информативным методом отбора клонов, и его результаты хорошо коррелируют с данными проточной цитометрии и вестерн-блоттинга.