Универсальная вирусная система для экспрессии и истощения белков в клетках млекопитающих

Способность экспрессировать или истощать белки в живых клетках имеет решающее значение для изучения биологических процессов. Вирусные векторы часто используются для доставки ДНК-конструктов в клетки, которые трудно трансфицировать другими методами. Лентивирусы обладают дополнительным преимуществом, поскольку способны интегрироваться в геномы неделящихся клеток млекопитающих. Однако существующие системы вирусной экспрессии обычно требуют различных векторных каркасов для экспрессии кДНК, малых шпилечных РНК (shRNA) или микроРНК (miRNA) и предлагают ограниченный набор маркеров лекарственной селекции. Кроме того, вирусные каркасы часто обладают рекомбинационной активностью в бактериях, что осложняет получение и поддержание нужных клонов. В данной работе мы описываем коллекцию из 59 векторов, образующих интегрированную систему для конститутивной или индуцируемой экспрессии кДНК, shRNA или miRNA и использующих широкий спектр маркеров лекарственной селекции. Эти векторы основаны на технологии Gateway (Invitrogen): представляющие интерес кДНК, shRNA или miRNA клонируют в Entry-вектор, а затем рекомбинируют с Destination-вектором, содержащим выбранные вирусный каркас и маркер лекарственной селекции. В результате этой реакции рекомбинации нужный продукт образуется с эффективностью >95%, что значительно снижает частоту нежелательной рекомбинации в бактериях. Мы создали Destination-векторы для получения как ретровирусов, так и лентивирусов. Кроме того, мы охарактеризовали каждый вектор по уровню продукции вирусного титра, а также по эффективности экспрессии или истощения представляющих интерес белков. Мы также создали несколько типов векторов для получения слитых белков и подтвердили экспрессию каждого из них. Мы продемонстрировали применимость этих векторов в различных функциональных исследованиях. Во-первых, мы показали, что система дестабилизирующего домена FKBP12 может использоваться для экспрессии или истощения представляющего интерес белка в клетках с митотической остановкой. Кроме того, мы получили первичные фибробласты, которые можно индуцировать к вступлению в состояние клеточного старения в присутствии или в отсутствие повреждения ДНК. Наконец, мы опред...