Экспрессия рекомбинантного человеческого цитохрома P450 1B1 в Escherichia coli

Человеческий цитохром P450 (P450) 1B1 экспрессировали в Escherichia coli на уровне 200 нмоль/л культуры с использованием вектора pCW путем удаления кодонов 2–4 и модификации нуклеотидной последовательности полученных семи N-концевых кодонов; сходный уровень экспрессии был достигнут с помощью бицистронной конструкции, которая также обеспечивала экспрессию человеческой NADPH–P450-редуктазы. P450 1B1 очищали из моноцистронной системы до электрофоретической однородности; удельное содержание составляло 9,2 нмоль P450/мг белка. Для очистки использовали хроматографию на DEAE, CM и гидроксиапатите. Абсолютные спектры показали значительную долю железа в высокоспиновом состоянии и небольшое количество цитохрома P420. Каталитическая активность очищенного фермента значительно усиливалась в присутствии холата. Как реконституированный P450 1B1, так и бактериальные мембраны, полученные с использованием бицистронной векторной системы, обладали сходной активностью O-деэтилирования 7-этоксирезоруфина; как и ожидалось, 17β-эстрадиол гидроксилировался преимущественно в 4-положении. Способность человеческого P450 1B1 активировать несколько гетероциклических аминов и дигидродиолов полициклических углеводородов была подтверждена с использованием реконституированного P450 1B1 и мембран P450 1B1, в которых совместно экспрессировалась NADPH–P450-редуктаза.