Рекомбинантный человеческий интерферон-γ: различия в гликозилировании и протеолитической обработке приводят к гетерогенности при периодическом культивировании

Рекомбинантный человеческий интерферон-γ (Hu-IFN-γ), продуцируемый клетками яичника китайского хомячка (CHO), анализировали методами иммунопреципитации и SDS/PAGE. Эта клеточная линия секретировала до двенадцати вариантов с различной молекулярной массой. После ферментативного удаления всех N-связанных олигосахаридов или при ингибировании гликозилирования туникамицином выявляли три варианта. Наличие трех полипептидных форм вместо одной указывало на протеолитическое расщепление в двух участках как гликозилированных, так и негликозилированных форм. Протеолитически расщепленный IFN-γ преобладал в клеточных лизатах по сравнению с секретируемым гликопротеином. Подобно природному IFN-γ, секретировались как полностью гликозилированный IFN-γ (с занятыми остатками аспарагина 28 и 100), так и частично гликозилированный продукт, предположительно замещенный в положении Asn28. Это заключение было сделано на основании молекулярных масс гликозилированных продуктов и относительного содержания сиаловой кислоты, связанной с каждым вариантом. В отличие от природного IFN-γ, трансфицированные клетки CHO также секретировали негликозилированный IFN-γ. При выращивании клеток в периодической культуре на бессывороточной среде при контролируемых значениях pH и концентрации растворенного кислорода доля негликозилированного IFN-γ увеличивалась с 3–5% через 3 ч до 30% от общего количества IFN-γ через 195 ч. Это изменение доли продуцируемого гликозилированного белка не наблюдалось при инкубации метаболически меченного IFN-γ в течение 96 ч с бесклеточным супернатантом активно растущих клеток CHO. Это указывало на изменение внутриклеточного гликозилирования, а не на деградацию олигосахаридных боковых цепей после секреции. Снижение степени гликозилирования IFN-γ не зависело от концентрации глюкозы в питательной среде, но могло быть связано с удельными скоростями роста и продукции IFN-γ, которые после 50 ч культивирования постепенно снижались одновременно с увеличением продукции негликозилированного IFN-γ.