Микроматричный анализ после амплификации РНК с использованием limma позволяет выявлять выраженные различия в экспрессии генов

ОБОСНОВАНИЕ: Амплификация РНК необходима для профилирования экспрессии генов в небольших образцах тканей. Предыдущие исследования показали, что методы амплификации на основе T7 являются воспроизводимыми, но могут искажать истинное количество мишеней. Однако последствия таких искажений для выявления биологической вариабельности экспрессии генов изучены недостаточно, чтобы определить реальную область применимости и ограничения этих методов амплификации. РЕЗУЛЬТАТЫ: Мы показываем, что отношения уровней экспрессии иногда искажаются при амплификации с использованием протокола Affymetrix для малых образцов, версия 2, вследствие непропорционального сдвига интенсивности между биологическими образцами. Это происходит, когда сдвиг в одном образце не может быть отражён в другом образце, поскольку интенсивность вышла бы за пределы динамического диапазона сканера. Интересно, что такие искажения чаще всего приводят к уменьшению отношений, вследствие чего снижается их статистическая значимость. Это особенно критично для менее выраженных отношений, для которых доказательства дифференциальной экспрессии недостаточно убедительны. Действительно, статистический анализ с использованием limma показывает, что до 87% генов с наиболее высокими и, следовательно, наиболее значимыми отношениями (p < 10e(-20)) в группе без амплификации имеют значение p ниже 10e(-20) в группе с амплификацией. С другой стороны, только 69% более умеренных отношений (10e(-20) < p < 10e(-10)) в группе без амплификации имеют значение p ниже 10e(-10) в группе с амплификацией. Наш анализ также показывает, что в целом статистика limma обеспечивает большее перекрытие между генами, признанными значимыми в группах с амплификацией и без амплификации, чем статистика на основе Z-оценок. ВЫВОДЫ: Мы заключаем, что микроматричный анализ амплифицированных образцов лучше всего выявляет различия в экспрессии генов, когда эти различия велики и используются статистические показатели limma.