Термодинамически запрограммированная однофазная CRISPR-платформа для генотипирования SNP в условиях близких к пациенту

Однофазные CRISPR-диагностические системы сталкиваются с фундаментальной несовместимостью: изотермическое амплифицирование нуклеиновых кислот обеспечивает быструю аккумуляцию мишени, тогда как активация CRISPR необратимо расходует эти субстраты, дестабилизируя кинетику реакции. В этой работе мы показываем, что порядок реакции можно запрограммировать в ДНК-примерах с помощью термодинамического проектирования. Различия в силе связывания праймеров создают две последовательные стадии амплификации, задерживая активацию CRISPR до накопления достаточного количества ампликонов без физического разделения или внешнего управления. В конструкцию также вводится протоспейсер-соседний мотив (PAM), короткая последовательность, необходимая для распознавания CRISPR, через праймер, а не полагаясь на её наличие в нативной мишени, что расширяет доступность целей при сохранении дискриминации по одиночным нуклеотидам. Модель обыкновенных дифференциальных уравнений описывает пороговое поведение и устанавливает предсказуемую основу для проектирования праймеров. На базе этого принципа мы разработали Thermodynamically Encoded Molecular Programming for One-pot diagnostics (TEMPO), которое достигает аттомолярной чувствительности в течение 30 минут и обеспечивает генотипирование SNP, согласующееся с секвенированием, и обнаружение патогенов в одноступенчатом микрофлюидном формате.