Количественный метод LC-MS/MS для различения форм тау-белка, фосфорилированной и нефосфорилированной в серине-396

Известно, что гиперфосфорилированный тау-белок участвует в образовании нейрофибриллярных клубков и прогрессировании возрастных нейродегенеративных заболеваний (тауопатий), включая болезнь Альцгеймера (БА). Тау-белок, фосфорилированный в серине-396 (pS396-tau), часто связывают с прогрессированием заболевания; поэтому мы разработали аналитический метод для измерения pS396-tau в ликворе (цереброспинальной жидкости, CSF) у людей и в модельных животных БА. В области S396 присутствует несколько сайтов фосфорилирования, что вызывает структурную сложность и проблемы с чувствительностью для обычных bottom-up методов масс-спектрометрии. Здесь мы представляем косвенный метод LC-MS/MS для количественного определения pS396-tau. Мы используем воспроизводимую неисправку расщепления (miscleavage), вызванную тем, что S396 предшествует лизин (K395), и тот факт, что протеолитический фермент трипсин не разрывает связь, когда следующий аминокислотный остаток фосфорилирован. Следовательно, обработка трипсином позволяет различать формы тау с фосфорилированием в S396 и без него, и pS396-tau может быть количественно определён как разница между общим S396-tau и нефосфорилированным S396-tau. Для квалификации метод успешно применяли для количественного определения pS396-tau в ликворе людей — у здоровых контролей и пациентов с лёгкими когнитивными нарушениями и БА. Кроме того, метод был применён к мышам rTg4510, где в ликворе наблюдалось чёткое дозозависимое снижение pS396-tau после внутривенного введения моноклонального антитела (Lu AF87908, hC10.2), нацеленного на эпитоп тау, содержащий pS396. Наконец, была проведена формальная валидация метода. В заключение, этот чувствительный метод на основе LC-MS/MS для измерения pS396-tau в ликворе позволяет применять количественные трансляционные биомаркеры для тауопатий, включая исследования потенциальных эффектов, вызванных препаратами.