Внутрисферный механизм восстановления молекулярного кислорода, катализируемого медьсодержащими аминооксидазами

Аминооксидазы, содержащие медь и топахинон (TPQ), используют O2 для метаболизма биогенных аминов, одновременно образуя H2O2 для использования клеткой. Механизм восстановления O2 долгое время оставался предметом дискуссий из-за затрудняющего интерпретацию влияния протон-сопряжённого переноса электрона между TPQ, производным тирозина, и медью; быстро устанавливающееся равновесие не позволяет однозначно определить реакционноспособную форму фермента. В настоящей работе показано, что аминооксидаза проростков гороха (PSAO), восстановленная субстратом, преимущественно существует в состоянии Cu(I), TPQ-семихинона. Новое механистическое объяснение восстановления O2 предложено на основании термодинамических соображений, кинетических исследований при различных pH, температурах и вязкостях, идентификации стационарных интермедиатов и анализа конкурентных кинетических изотопных эффектов кислорода, KIE по (18)O, [kcat/KM((16,16)O2)]/[kcat/KM((16,18)O2)]. KIE по (18)O, равный 1,0136 ± 0,0013 при pH 7,2, не зависит от температуры в диапазоне от 5 до 47 °C и незначительно изменяется до 1,0122 ± 0,0020 при повышении pH до 9, что указывает на отсутствие кинетической сложности. Согласно расчётам методами теории функционала плотности, этот эффект точно соответствует диапазону, ожидаемому для обратимого связывания O2 с Cu(I) с образованием интермедиата супероксида [Cu(II)(η1-O2)(−I)]+. На первой необратимой стадии за ним следует перенос электрона от TPQ-семихинона с образованием пероксидного интермедиата Cu(II)(η1-O2)(−II), что приводит к восстановлению O2. Сходные KIE по (18)O, зарегистрированные для медьсодержащих аминооксидаз из других источников, позволяют предположить, что все такие ферменты реагируют по родственному внутрисферному механизму, хотя для проверки этого предположения необходимы дополнительные эксперименты.