Система экспрессии на основе клеток HEK293 для стабильного получения рекомбинантного эритропоэтина

Клеточные линии млекопитающих являются предпочтительными системами экспрессии для производства сложных терапевтических препаратов и рекомбинантных белков. Однако наиболее широко используемые системы на основе клеток млекопитающих — клетки яичника китайского хомячка (CHO), а также клетки миеломы мыши Sp2/0 и NS0 — могут продуцировать гликопротеины с гликанами нечеловеческого происхождения, которые потенциально способны вызывать иммуногенные реакции. Поэтому мы разработали полностью человеческую систему экспрессии на основе клеток HEK293 для стабильного получения рекомбинантных белков с высоким титром, предварительно нокаутировав ген GLUL, кодирующий глутаминсинтетазу, с использованием системы CRISPR-Cas9. Затем были созданы векторы экспрессии, в которых человеческий GLUL использовался в качестве селекционного маркера; в качестве модельного белка применяли рекомбинантный человеческий эритропоэтин (EPO). Селекцию проводили с использованием метионинсульфоксимина (MSX) для отбора клеток с высокой экспрессией EPO. В 2-литровом биореакторе с перемешиваемым резервуаром, работающем в режиме подпитываемой периодической культуры, была продемонстрирована продукция EPO до 92 700 Ед/мл по данным ИФА или 696 мг/л по данным денситометрии. Анализ методом масс-спектрометрии показал, что N-гликозилирование полученного EPO было сходно с таковым у эндогенных человеческих белков, а эпитопы гликанов нечеловеческого происхождения не обнаруживались. В совокупности результаты подчеркивают возможность использования клеточной системы экспрессии человека для получения EPO с высоким титром и без ксеногенных компонентов, а также, вероятно, других сложных рекомбинантных белков.