Крупномасштабная транзиентная трансфекция клеток CHO в бессывороточной среде

До настоящего времени методы крупномасштабной транзиентной экспрессии генов (TGE) в культивируемых клетках млекопитающих основывались на использовании двух агентов трансфекции: полиэтиленимина (PEI) и фосфата кальция (CaPi). Было показано, что оба метода обеспечивают высокую эффективность трансфекции при масштабах свыше 10 л. Однако оба подхода приводят к более высоким уровням продукции рекомбинантного белка (r-белка) в присутствии сыворотки, чем при ее отсутствии. Поскольку сыворотка является существенным фактором затрат и препятствует очистке белка, целью работы была разработка крупномасштабного процесса TGE для клеток яичника китайского хомячка (CHO) в бессывороточной среде. Клетки CHO-DG44 культивировали и трансфицировали в химически определенной среде, используя линейный PEI с молекулярной массой 25 кДа в качестве агента трансфекции. Оптимизировали количество ДНК, соотношение ДНК к PEI, время и условия раствора для образования комплекса, среду трансфекции и плотность клеток на момент трансфекции. Наиболее высокие уровни экспрессии r-белка наблюдались при трансфекции культур с плотностью 2,0 x 10(6) клеток/мл с использованием 2,5 мкг/мл ДНК в среде RPMI 1640, содержащей 25 мМ HEPES при pH 7,1. Трансфекционный комплекс формировали при массовом соотношении ДНК:PEI 1:2 в 150 мМ NaCl, инкубируя его 10 мин при комнатной температуре перед добавлением в культуру. Процедуру масштабировали до 20-литрового биореактора, что обеспечило уровни экспрессии 10