Молекулярное клонирование и функциональная характеристика псораленсинтазы — первой специфичной монооксигеназы биосинтеза фуранокумаринов

Ammi majus L. накапливает линейные фуранокумарины посредством зависимого от цитохрома P450 (CYP) превращения 6-пренилумбеллиферона через (+)-мармезин в псорален. Соответствующая активность, псораленсинтазная, быстро индуцируется от незначительного исходного уровня после элиситации культур A. majus, достигая кратковременного максимума через 9–10 ч, и обнаруживается в лабильных микросомах. Экспрессируемые метки последовательностей были клонированы из элицитированных клеток Ammi с использованием стратегии вложенной DD-RT-PCR со специфичными к CYP праймерами; на основе фрагментов, содержание которых коррелировало с профилем индукции фуранокумарин-специфичных активностей, были получены полноразмерные кДНК. Одна из этих кДНК, соответствующая транскрипту с максимальным содержанием через 4 ч после элиситации, была обозначена как CYP71AJ1. Первоначально функциональная экспрессия в клетках Escherichia coli или дрожжей не удавалась, однако в конечном итоге она была достигнута в дрожжевых клетках после замены N-концевого домена мембранного якоря доменом CYP73A1. Рекомбинантный фермент был идентифицирован как псораленсинтаза, обладающая узкой субстратной специфичностью к (+)-мармезину. Псораленсинтаза катализирует уникальную реакцию расщепления углеродной цепи, сопровождающуюся высвобождением ацетона посредством син-элиминирования. Известно, что родственные растения, такие как Heracleum mantegazzianum, продуцируют как линейные, так и угловые фуранокумарины посредством аналогичного превращения 8-пренилумбеллиферона через (+)-колумбианетин в ангелицин; предполагалось, что ангелицинсинтаза произошла от псораленсинтазы. Однако (+)-колумбианетин не служил субстратом, а конкурентно ингибировал активность псораленсинтазы. Аналоговое моделирование и докинг определили условия высокоаффинного связывания субстрата и позволили предсказать минимальные изменения, необходимые для размещения (+)-колумбианетина в полости активного центра. Исследование показало, что для начала эволюционного перехода к ангелицинсинтазе необходимы несколько точечных мутаций.