Секвенирование ДНК в реальном времени по отдельным молекулам ДНК-полимеразы
Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules
2008-11-20
SCID: 54.1/q9puw2by
Discuss with AI
ДНК-полимеразафлуоресцентно-меченные дНТФдинамика полимеризациисеквенирование в реальном времени на уровне отдельных молекулмассивы волноводов нулевой моды
Figures from the paper
Abstract (AI)
Представлены данные одномолекулярного секвенирования в реальном времени, полученные при непрерывном синтезе ДНК-полимеразой комплементарной цепи по матрице с использованием четырех различимых флуоресцентно меченных дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (dNTP). Временной порядок их ферментативного включения в растущую цепь ДНК определяли с помощью массивов наноструктур волноводов нулевого режима, которые ограничивают объем оптического наблюдения и обеспечивают параллельное одновременное детектирование тысяч одномолекулярных реакций секвенирования. Конъюгация флуорофоров с концевой фосфатной группой dNTP позволяет непрерывно наблюдать синтез ДНК протяженностью в тысячи оснований без стерических препятствий. Эти данные непосредственно отражают динамику полимеразы, выявляя различные состояния полимеризации и участки пауз, соответствующие вторичной структуре ДНК. Данные секвенирования выравнивали с известной референсной последовательностью для оценки биофизических параметров полимеризации в каждом положении матрицы. Консенсусные последовательности строили по одномолекулярным прочтениям при 15-кратном покрытии; медианная точность составила 99,3%, при этом систематических ошибок, помимо ошибок, зависящих от флуорофора, не обнаружено.
Key Findings
1
При 15-кратном покрытии консенсусные последовательности достигли медианной точности 99,3%, без систематических ошибок, кроме ошибок, зависящих от флуорофора.
2
Данные отдельных молекул выявили различные состояния полимеризации и участки пауз, связанные со вторичной структурой ДНК.
3
Было реализовано секвенирование ДНК в реальном времени на уровне отдельных молекул путем наблюдения непрерывного синтеза полимеразой с использованием четырех различимых флуоресцентных дНТФ.
4
Мечение флуорофорами концевой фосфатной группы позволило непрерывно наблюдать синтез ДНК протяженностью в тысячи оснований без стерических препятствий.
5
Массивы волноводов нулевой моды обеспечили оптическое ограничение области наблюдения и параллельную регистрацию тысяч отдельных реакций секвенирования.
Research Object
отдельные молекулы ДНК-полимеразы, осуществляющие синтез ДНК по матрице в реальном времени
Research Subject
временная последовательность включения нуклеотидов, динамика полимеразы, паузы на участках вторичной структуры ДНК и точность секвенирования при непрерывном синтезе
Publication Details
Publication Date
2008-11-20
Journal
Publisher
ISSN
Access Type
Author Information
Download PDF
Subscribe to digest