Кольцевая РНК CDR1as нарушает комплекс p53/MDM2 и подавляет глиомагенез

ВВЕДЕНИЕ: Инактивация супрессора опухолей p53 имеет ключевое значение для патогенеза глиомы, особенно мультиформной глиобластомы (GBM). MDM2, основной негативный регулятор p53, связывается с p53 и образует с ним стабильный комплекс, регулируя его активность. До настоящего времени оставалось неясным, влияет ли стабильность комплекса p53/MDM2 на длинные некодирующие РНК (lncRNA), в частности на кольцевые РНК, которые обычно отличаются высокой представленностью и консервативностью и часто участвуют в различных онкогенных процессах. МЕТОДЫ: Для определения наиболее обогащённых lncRNA, включая кольцевые РНК, связанных с p53, были выполнены RIP-seq- и RIP-qPCR-анализы, после чего проведены биоинформатические анализы для оценки связи их экспрессии с сигнальным путём p53 и глиомагенезом. Затем клиническая значимость CDR1as была оценена в крупнейшей когорте китайских пациентов с глиомой из CGGA (n = 325), а её экспрессия в тканях глиом человека дополнительно оценена с помощью флуоресцентной гибридизации РНК in situ (RNA FISH) и количественной ПЦР с обратной транскрипцией (RT-qPCR) соответственно. Для определения колокализации CDR1as и p53 были выполнены анализы, сочетающие RNA FISH с иммунофлуоресценцией белка, после чего взаимодействие РНК с белком подтверждали с помощью анализов выделения хроматина методом очистки РНК (CHIRP). Иммуноблоттинг использовали для оценки экспрессии белков, взаимодействия p53/MDM2 и убиквитинирования p53 в клетках с изменённой экспрессией CDR1as. После подавления AGO2 или Dicer для ингибирования биогенеза микроРНК влияние CDR1as на экспрессию, стабильность и активность p53 определяли с помощью иммуноблоттинга, RT-qPCR и люциферазных репортёрных анализов. Одновременно влияние CDR1as на повреждение ДНК оценивали методом проточной цитометрии и иммуногистохимии. Для определения влияния CDR1as на образование колоний, пролиферацию клеток, клеточный цикл и апоптоз in vitro, а также на объём и массу опухоли и выживаемость голых мышей с ксенотрансплантатами клеток GBM in vivo были проведены анализы опухолеобразования. РЕЗУЛЬТАТЫ: Было обнаружено, что CDR1as связывается с белком p53. Экспрессия CDR1as снижается с повышением степени злокачественности глиомы, и она является надёжным независимым...