Конструирование микросомального цитохрома P450 2C5 в растворимый мономерный фермент

Удаление N-концевого трансмембранного домена из микросомальных P450 2C5 и 2C3 приводит к образованию ферментов 2C5dH и 2C3dH соответственно, которые демонстрируют зависимое от концентрации соли связывание с мембранами, указывая на сохранение у них монофазного домена взаимодействия с мембраной. В буферах с высокой концентрацией соли эти два белка существуют соответственно в виде тетрамеров и димеров, причем только 2C5dH требует фосфолипидов для полного восстановления каталитической активности фермента. Аминокислотные остатки P450 2C3dH в положениях с 201 по 210 были заменены на соответствующие остатки P450 2C5, чтобы выявить замены, способные ослабить взаимодействие с мембраной, зависимость катализа от фосфолипидов и агрегацию 2C5dH. Каждая из четырех замен — N202H, I207L, S209G и S210T — уменьшала агрегацию P450 2C5dH и приводила к образованию мономерного фермента. Мутации N202H и I207L также снижали стимуляцию каталитической активности фосфолипидами и уменьшали связывание P450 2C5dH с фосфолипидными везикулами. Модифицированные ферменты демонстрируют скорости 21-гидроксилирования прогестерона, сходные со скоростью P450 2C5dH. Эти условно мембраносвязанные P450 с повышенной растворимостью в буферах с высокой концентрацией соли пригодны для кристаллизации и определения структуры методом рентгеновской дифракции.