Изотопные эффекты белка в дигидрофолатредуктазе из Geobacillus stearothermophilus показывают компенсирующие энтропно‑энергетические эффекты на константу скорости

Катализ дигидрофолатредуктазы из умеренно термофильной бактерии Geobacillus stearothermophilus (BsDHFR) был исследован методом изотопной замены в белке. Кинетический изотопный эффект фермента для переноса гидрида был близок к единице при физиологических температурах, но увеличивался с понижением температуры до значения 1,65 при 5 °C. Такое поведение противоположно наблюдаемому для DHFR из Escherichia coli (EcDHFR), где кинетический изотопный эффект фермента незначительно возрастал с повышением температуры. Эти экспериментальные результаты были воспроизведены в рамках вариационной теории переходного состояния, включающей динамический коэффициент повторного прохождения (recrossing), который зависит от массы белка. Наши моделирования указывают, что BsDHFR обладает большей гибкостью, чем EcDHFR, на временных масштабах пс–нс, что влияет на сопряжение окружающих движений белка с химической координатой и, следовательно, на траектории повторного прохождения через энергетический барьер реакции. Интенсивность динамического сопряжения в DHFR определяется компенсирующими факторами, зависящими от температуры, а именно энтальпийным барьером, необходимым для достижения оптимальной конфигурации переходного состояния с минимальным числом непродуктивных траекторий, и беспорядком в белке, нарушающим электростатическую предорганизацию, требующуюся для стабилизации переходного состояния. В сочетании с нашими предыдущими исследованиями других DHFR, представленные результаты дают общее объяснение тому, почему динамические эффекты белка различаются между ферментами. Наш теоретический подход демонстрирует, что эти эффекты можно удовлетворительно воспроизвести, включая в расчет константы скорости коэффициент пропускания, зависимость которого от температуры определяется гибкостью белка.