Внеклеточные нанопузырьки для упаковки белка CRISPR-Cas9 и sgRNA с целью индукции терапевтического пропуска экзонов

Длительная экспрессия нуклеазы CRISPR-Cas9 и направляющей РНК (gRNA) из вирусных векторов может приводить к мутагенезу вне мишени и иммуногенности. Поэтому для терапевтического редактирования генома необходима система транзиентной доставки. В настоящей работе разработана система доставки рибонуклеопротеиновых комплексов на основе внеклеточных нанопузырьков, получившая название NanoMEDIC и использующая два различных механизма адресного нацеливания. Химически индуцированная димеризация рекрутирует белок Cas9 во внеклеточные нанопузырьки, после чего сигнал упаковки вирусной РНК и два саморасщепляющихся рибопереключателя обеспечивают присоединение и высвобождение sgRNA в нанопузырьки. Показано эффективное редактирование генома в различных типах клеток, трудно поддающихся трансфекции, включая индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPS-клетки) человека, нейроны и миобласты. NanoMEDIC также обеспечивает эффективность пропуска экзонов более 90% в клетках скелетной мускулатуры, полученных из iPS-клеток пациентов с мышечной дистрофией Дюшенна (DMD). Наконец, однократная внутримышечная инъекция NanoMEDIC индуцирует стабильный геномный пропуск экзонов у мышей-репортеров люциферазы и мышей mdx, что свидетельствует о перспективности этой системы для терапии DMD и других заболеваний посредством редактирования генома in vivo.