Высокоэффективное РНК-направляемое редактирование генома в клетках человека посредством доставки очищенных рибонуклеопротеинов Cas9

РНК-направляемые инженерные нуклеазы (RGEN), происходящие от прокариотической адаптивной иммунной системы, известной как CRISPR (clustered, regularly interspaced, short palindromic repeat)/Cas (CRISPR-associated), позволяют редактировать геном в линиях клеток человека, животных и растений, но ограничены побочными эффектами и нежелательной интеграцией сегментов ДНК, происходящих из плазмид, кодирующих Cas9 и направляющую РНК, как в целевых, так и в офф-таргетных участках генома. В настоящей работе мы доставляем очищенный рекомбинантный белок Cas9 и направляющую РНК в культивируемые клетки человека, включая труднотранфектируемые фибробласты и плюрипотентные стволовые клетки. Рибонуклеопротеины RGEN (RNP) индуцируют сайт-специфические мутации с частотами до 79%, одновременно снижая офф-таргетные мутации, связанные с трансфекцией плазмидами, в офф-таргетных участках, отличающихся на один или два нуклеотида от целевых сайтов. RGEN RNP разрезают хромосомную ДНК почти сразу после доставки и быстро деградируют в клетках, что уменьшает офф-таргетные эффекты. Кроме того, доставка RNP менее стрессова для эмбриональных стволовых клеток человека, давая по крайней мере в два раза больше колоний по сравнению с трансфекцией плазмидами.