Выделение и функциональная характеристика CYP71AJ4, кодирующего первую P450-монооксигеназу биосинтеза угловых фуранокумаринов

Биосинтез линейных и угловых фуранокумаринов на молекулярном уровне всё ещё изучен недостаточно; из растения Ammi majus была идентифицирована только псораленсинтаза (CYP71AJ1). С использованием кДНК-зондов, разработанных на основе CYP71AJ1, были выделены три ортолога из Apium graveolens (CYP71AJ2) и Pastinaca sativa (CYP71AJ3 и CYP71AJ4), после чего их функционально экспрессировали в клетках дрожжей. CYP71AJ2 и CYP71AJ3 проявляли активность псораленсинтазы, тогда как CYP71AJ4 катализировал только превращение (+)-колумбианетина в ангелицин и образование незначительных количеств гидроксилированного побочного продукта — колумбианетина. Таким образом, CYP71AJ4 является первой полностью охарактеризованной P450-монооксигеназой, специфичной для пути биосинтеза угловых фуранокумаринов. Для ангелицинсинтазы кажущаяся K(m) при использовании (+)-колумбианетина составляла 2.1 +/- 0.4 microm, а k(cat) — 112 +/- 14 min(-1). Кроме того, использование 3'-дейтерированного (+)-колумбианетина в качестве субстрата приводило почти к полному «метаболическому переключению», в результате чего синтезировался anti-3'-гидрокси-3'-дейтерированный (+)-колумбианетин. Это подтверждает, что ангелицинсинтаза атакует колумбианетин посредством syn-элиминирования водорода из положения C-3'. Сравнение последовательностей псораленсинтазы (CYP71AJ3) и ангелицинсинтазы (CYP71AJ4) показало 70%-ную идентичность, тогда как в областях, предположительно формирующих сайты распознавания субстрата, идентичность снижалась до 40%. Следовательно, CYP71AJ3 и CYP71AJ4 могли произойти от общего предка с неизвестной функциональностью в результате дупликации гена и последующей молекулярной эволюции.