Протоколы внедрения клеточно-свободной системы экспрессии TX-TL на основе Escherichia coli для синтетической биологии

Идеальные клеточно-свободные системы экспрессии теоретически могут имитировать in vivo клеточную среду на контролируемой in vitro платформе. Это полезно для контролируемой экспрессии белков и генетических цепей, а также для предоставления среды прототипирования для синтетической биологии. Для достижения последней цели клеточно-свободные системы экспрессии, сохраняющие эндогенные механизмы транскрипции и трансляции Escherichia coli, способны точнее отражать in vivo клеточную динамику по сравнению с системами, основанными на транскрипции с помощью РНК-полимеразы T7. Мы описываем подготовку и выполнение эффективной эндогенной клеточно-свободной системы транскрипции-трансляции (TX-TL) на основе E. coli, которая может производить эквивалентные количества белка по сравнению с системами на основе T7 при снижении стоимости на 98% по сравнению с аналогичными коммерческими системами. Описана подготовка буферов и грубого клеточного экстракта, а также проведение тройного TX-TL реакции. Весь протокол занимает пять дней на подготовку и дает достаточно материала для хранения до 3000 отдельных реакций в одной подготовке. После подготовки каждая реакция занимает менее 8 часов от установки до сбора данных и анализа. Могут быть добавлены механизмы регуляции и транскрипции, экзогенные для E. coli, такие как репрессоры lac/tet и РНК-полимераза T7. Также можно регулировать эндогенные свойства, такие как скорости деградации мРНК и ДНК. Система клеточно-свободной экспрессии TX-TL была продемонстрирована для масштабной сборки цепей, исследования биологических явлений и экспрессии белков как под промоторами T7, так и под эндогенными промоторами. Прилагаются математические модели. Полученная система обладает уникальными приложениями в синтетической биологии в качестве среды прототипирования, или «TX-TL биомолекулярной макетной платы».