Быстрая и высокоэффективная инженерия клеток млекопитающих посредством трансфекции белком Cas9

Системы CRISPR-Cas9 обеспечивают платформу для высокоэффективного редактирования генома, открывая возможности для инновационного применения инженерии клеток млекопитающих. Однако доставка Cas9 и синтез направляющей РНК (gRNA) остаются этапами, которые могут ограничивать общую эффективность и удобство использования. Здесь мы описываем методы быстрого синтеза gRNA и доставки рибонуклеопротеиновых комплексов, состоящих из белка Cas9 и gRNA (Cas9 RNP), в различные клетки млекопитающих посредством трансфекции, опосредованной липосомами, или электропорации. С использованием этих методов мы получили опосредованную нуклеазой частоту инсерций/делеций (indel) до 94% в Т-клетках Jurkat и 87% в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках (iPSC) для одной мишени. При применении этого подхода для одновременного редактирования нескольких генов в клетках Jurkat двухлокусные и трёхлокусные indel были выявлены примерно в 93% и 65% полученных изолированных клеточных линий соответственно. Кроме того, мы обнаружили, что частота внесайт-специфического расщепления снижалась при использовании белка Cas9 по сравнению с трансфекцией плазмидной ДНК. В совокупности мы представляем оптимизированный рабочий процесс клеточной инженерии, позволяющий пройти путь от разработки gRNA до анализа отредактированных клеток всего за четыре дня и обеспечивающий высокоэффективную модификацию генома в клетках, плохо поддающихся трансфекции. Подготовка реагентов и их доставка в клетки пригодны для высокопроизводительной, мультиплексной полногеномной клеточной инженерии.