Набор инструментов CRISPR/Cas9 для мультиплексного редактирования генома у растений

Предпосылки: Для ускорения применения системы CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9) к различным видам растений требуется набор инструментов с дополнительными растительными селекционными маркерами, большим количеством модулей gRNA и более простыми методами сборки одной или нескольких экспрессионных кассет gRNA. Результаты: Мы разработали набор бинарных векторов CRISPR/Cas9 на основе рамки pGreen или pCAMBIA, а также набор векторов-модулей gRNA (guide RNA) в качестве набора инструментов для мультиплексного редактирования генома у растений. Для получения финальных конструкций, содержащих казанооптимизированный Cas9 и одну или несколько gRNA с высокой эффективностью, этот набор требует только рестриктазы BsaI и позволяет получить конструкцию за один этап клонирования. Набор был валидирован на протопlastах кукурузы, трансгенных линиях кукурузы и трансгенных линиях Arabidopsis и показал высокую эффективность и специфичность. Более важно, с использованием этого набора в трансгенных саженцах поколения T1 были обнаружены целевые мутации трех генов Arabidopsis. Кроме того, множественные генные мутации могли передаваться следующему поколению. Выводы: Мы разработали набор инструментов, который облегчает временную или стабильную экспрессию системы CRISPR/Cas9 в различных видах растений и будет способствовать растительным исследованиям, так как позволяет эффективно получать мутанты с множественными генными мутациями.