Высокоэффективная трансформация клеток млекопитающих плазмидной ДНК

Мы описываем простой протокол трансфекции фосфатом кальция и векторы с маркером neo, обеспечивающие высокоэффективную трансформацию клеток млекопитающих. В рамках этого протокола комплекс фосфат кальция–ДНК постепенно образуется в питательной среде во время инкубации с клетками и осаждается на клетках. Критическими факторами, обеспечивающими эффективную трансформацию, являются pH (6,95) буфера, используемого для осаждения фосфата кальция, уровень CO2 (3%) во время инкубации ДНК с клетками, а также количество (от 20 до 30 мкг) и форма ДНК (кольцевая). В резком отличие от результатов, полученных с кольцевой ДНК, линейная ДНК практически неактивна. В этих условиях 50% клеток мыши L(A9) могут быть стабильно трансформированы с помощью pcDneo — векторной конструкции с маркером neo (устойчивость к неомицину), основанной на вирусе SV40. Клеточные линии NIH3T3, C127, CV1, BHK, CHO и HeLa трансформировались с эффективностью от 10 до 50% с использованием этого вектора, а также векторов pcD, содержащих маркер neo, которые применялись для создания и трансдукции библиотек экспрессии кДНК и для экспрессии клонированной кДНК в клетках млекопитающих.