Трансфекция клеток млекопитающих: оптимизация критических параметров, влияющих на образование кальций-фосфатного осадка

ДНК–кальций-фосфатные сопреципитаты самопроизвольно образуются в пересыщенных растворах. Однако высокоэффективные осадки для трансфекции можно получить только в очень узком диапазоне физико-химических условий, определяющих начало и рост преципитатных комплексов. Концентрации кальция и фосфата являются основными факторами, влияющими на характеристики преципитатного комплекса, однако важную роль играют и другие параметры, такие как температура, концентрация ДНК и время реакции. Например, практически вся растворимая ДНК в реакционной смеси может связаться с кальций-фосфатом в нерастворимый комплекс менее чем за 1 мин. Увеличение времени реакции до 20 мин приводит к агрегации и/или росту частиц и снижает уровень экспрессии. Благодаря усовершенствованным протоколам были достигнуты более высокая воспроизводимость и эффективность как транзиторной, так и стабильной трансфекции. До 60% клеток окрашивались положительно на бета-галактозидазу, а транзиторная продукция секретируемых белков увеличилась в 5–10 раз по сравнению с результатами трансфекций, выполненных стандартными методами. Аналогичное повышение эффективности, оцениваемое по числу колоний рекомбинантных клеток, наблюдалось при стабильной трансфекции с использованием котрансфицированных плазмид-маркеров для отбора. Уровни транзиторной экспрессии через 2 дня после переноса ДНК и титры, полученные от стабильных клеточных линий, формировавшихся спустя несколько недель, демонстрировали сильную корреляцию.