Сайт-направленные мутации в грибной лакказе: влияние на окислительно-восстановительный потенциал, активность и профиль pH

В лакказе Myceliophthora thermophila и лакказе Rhizoctonia solani были внесены мутации в пентапептидный участок, предположительно расположенный вблизи центра Cu типа 1. Мутация L513F в лакказе Myceliophthora и мутация L470F в лакказе Rhizoctonia затрагивали положение, соответствующее аксиальному лиганду — метионину (M517) — центра Cu типа 1 в аскорбатоксидазе кабачка. Тройные мутации V509L, S510E, G511A в лакказе Myceliophthora и L466V, E467S, A468G в лакказе Rhizoctonia затрагивали участок последовательности, гомолог которого в аскорбатоксидазе фланкирован M517 и гистидином (H512), координирующим Cu типа 1. Одиночные мутации не приводили к значимым изменениям ферментативных свойств, включая сколько-нибудь значимое повышение окислительно-восстановительного потенциала Cu типа 1. Напротив, тройные мутации вызывали ряд существенных изменений. По сравнению с диким типом тройные мутанты лакказы Rhizoctonia и Myceliophthora характеризовались активностью в отношении фенолов, оптимум pH которой смещался соответственно на 1 единицу в кислую и щелочную сторону. Хотя окислительно-восстановительные потенциалы существенно не изменялись, мутации значительно влияли на Km, kcat и ингибирование лакказ фторидом. Наблюдаемые эффекты интерпретируются как возможные структурные возмущения, индуцированные мутациями и затрагивающие молекулярное распознавание между восстанавливающим субстратом и лакказой, а также перенос электрона от субстрата к центру Cu типа 1.