Анализ побочных эффектов РНК-направленных эндонуклеаз и никназ, полученных из системы CRISPR/Cas

РНК-направленные эндонуклеазы (RGEN), происходящие от прокариотической адаптивной иммунной системы, известной как CRISPR/Cas, обеспечивают целевую генную инженерию в клетках и организмах. RGEN представляют собой рибонуклеопротеины, состоящие из направляющей РНК и Cas9 — белкового компонента, происходящего от Streptococcus pyogenes. Эти ферменты разрезают хромосомную ДНК, чья последовательность комплементарна направляющей РНК, в целенаправленном месте, создавая специфические двухцепочечные разрывы ДНК (DSB), восстановление которых приводит к целевым модификациям генома. Несмотря на широкий интерес к редактированию генома с помощью RGEN, применение этих нуклеаз ограничено побочными мутациями и нежелательными хромосомными транслокациями, связанными с нецелевыми разрезами ДНК. Здесь мы показываем, что побочные эффекты RGEN можно снизить ниже пределов обнаружения глубокого секвенирования, выбирая уникальные целевые последовательности в геноме и модифицируя как направляющую РНК, так и Cas9. Мы установили, что как состав, так и структура направляющей РНК могут влиять на активность RGEN в клетках с целью уменьшения побочных эффектов. RGEN эффективно различали целевые сайты и внецелевые сайты, отличающиеся двумя нуклеотидами. Более того, анализ экзомного секвенирования показал, что два RGEN не индуцировали внецелевых мутаций в четырёх клональных популяциях мутантных клеток. В дополнение, парные Cas9-никназы, состоящие из D10A Cas9 и направляющей РНК и создающие два одноцепочечных разрыва (SSB) или «надреза» на разных цепях ДНК, были высокоспецифичны в человеческих клетках, избегая внецелевых мутаций без ущерба для эффективности редактирования генома. Интересно, что парные никназы индуцировали хромосомные делеции целенаправленно, не вызывая нежелательных транслокаций. Наши результаты подчёркивают важность выбора уникальных целевых последовательностей и оптимизации направляющей РНК и Cas9 для предотвращения или снижения внецелевых мутаций, вызванных RGEN.