Амплификация почти полноразмерных провирусов ВИЧ-1 для секвенирования нового поколения

Метод полногеномного секвенирования индивидуальных провирусов (Full-Length Individual Proviral Sequencing, FLIPS) представляет собой эффективный высокопроизводительный подход, предназначенный для амплификации и секвенирования отдельных почти полноразмерных (интактных и дефектных) провирусов ВИЧ-1. Метод FLIPS позволяет определить генетический состав интегрированного ВИЧ-1 в популяции клеток. Выявляя дефекты в последовательностях провируса ВИЧ-1, возникающие в ходе обратной транскрипции, включая крупные внутренние делеции, приводящие к потере функции стоп-кодоны и гипермутацию, мутации со сдвигом рамки считывания, а также мутации или делеции в цис-действующих элементах, необходимых для созревания вирионов, метод FLIPS позволяет идентифицировать интегрированные провирусы, неспособные к репликации. Метод FLIPS может применяться для выявления провирусов ВИЧ-1, не имеющих таких дефектов и поэтому потенциально способных к репликации. Протокол FLIPS включает лизис инфицированных ВИЧ-1 клеток, гнездную ПЦР почти полноразмерных провирусов ВИЧ-1 с использованием праймеров, направленных на 5′- и 3′-длинные концевые повторы (LTR) ВИЧ-1, очистку и количественную оценку ДНК, подготовку библиотек для секвенирования нового поколения (NGS), секвенирование нового поколения, de novo сборку контигов провирусов и простой процесс исключения для идентификации провирусов, способных к репликации. Метод FLIPS имеет преимущества перед традиционными методами секвенирования интегрированных провирусов ВИЧ-1, такими как секвенирование отдельных провирусов. FLIPS амплифицирует и секвенирует почти полноразмерные провирусы, что позволяет определить их репликационную компетентность, а также использует меньшее число амплификационных праймеров, предотвращая последствия несовпадений праймеров. Метод FLIPS является полезным инструментом для изучения генетического ландшафта интегрированных провирусов ВИЧ-1, особенно в латентном резервуаре; однако его применение может быть расширено на любые задачи, требующие определения генетического состава интегрированного ВИЧ-1.